簡述細胞培養的基本步驟


細胞培養細胞培養技術也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。現代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術,而這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切關系,特別是在醫藥領域的發展,細胞培養更具有特殊的作用和價值。以下來具體講一下細胞培養的步驟。
 
細胞培養的步驟
細胞復蘇:
1. 將新鮮培養基置于37℃水浴鍋中回溫,回溫后噴以75%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內。如配置:50mL完全培養基(含10%FBS,1%青鏈霉素雙抗)
44.5mL基礎培養基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。
2. 戴防護手套后,自液氮罐中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水槽中快速解凍(避免冰晶重新結晶而造成細胞死亡),輕搖冷凍管使其在2分鐘內全部融化,以75%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。
3. 將解凍的1mL細胞懸液緩緩加入細胞培養瓶內,再向瓶中加入10mL完全培養基(稀釋比例為1:10),混合均勻,放入37℃,5%CO2的恒溫培養箱中培養。取0.1ml解凍細胞懸液作存活測試。(Sf9細胞在27℃生長,可不需CO2)
4. 一般而言,細胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除,則將解凍的細胞懸液加入含有5-10ml培養基之離心管內,離心1300rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養基,混合均勻,放入CO2培養箱培養。若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養后隔日更換培養基。
 
傳代培養:
1. 37℃恒溫培養約48小時,待細胞長滿80-90%后,從培養箱取出75cm2培養瓶,倒掉培養基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清,倒掉緩沖液。
2. 沿壁(無細胞的一面)緩緩加入1mL胰酶溶液消化細胞約1min,輕輕搖晃,倒掉殘余胰酶,將培養瓶置于恒溫箱中約1min,拿出培養瓶輕輕拍打一下細胞貼壁的一面。
注意:最佳消化溫度是37℃,加液后用移液管反復吹打分散細胞。
3. 向瓶中加入5mL完全培養基,反復吹打均勻2min,從中取出20μl至0.5ml小離心管中,向管中加入80μl臺盼藍溶液,混勻,從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數板上,計算細胞密度及活率。
4. 將5mL細胞懸液全部吸出,分別接種1mL懸液到原培養瓶和另一新的培養瓶中,其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL完全培養基,置于CO2培養箱培養。(細胞傳代時按1:5或更大比例稀釋)
 
細胞計數與存活測試:
1. 取10μl混合液自血球計數盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色。
2. 計數四個大方格的細胞總數。計數板計數時,最適濃度為5~10×105細胞/ml。高濃度細胞懸液,可取出部分稀釋后計數。
3. 每一大格的體積為0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若細胞位于線上,只計左線與上線的細胞。
注:細胞密度= 四大格細胞總數×稀釋倍數×104/4= 細胞數/ml;
細胞活率= 活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。
 
細胞凍存:
1. 冷凍前確保細胞處于指數生長期,傳代后的5mL細胞懸液取出1mL接種到培養瓶繼續傳代。另取一無菌離心管,將剩余4mL細胞懸液置于其中,離心1000rpm,5min(轉速勿超過1500rpm)。
2. 離心后倒掉上層清液,收集下層細胞沉淀。向離心管中加入900ul完全培養基,用槍頭反復吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。
3. 將細胞懸液轉入1.5mL無菌凍存管中,再加入100ul試劑級DMSO,混勻,制成細胞凍存懸液(DMSO最后濃度為10%)。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期,然后進行凍存。
注意:對Sf9細胞而言,凍存比例為:95%培養液+5%DMSO。
5. 傳統方法:冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(隔夜)→液氮罐長期儲存。(-20℃勿超過1小時,防止胞內冰晶過大造成細胞死亡)
 
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